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Amniocentesi Tradizionale - Amniocentesi Molecolare (Array-CGH) - QF-PCR - Screening Malattie Genetiche

Amniocentesi Tradizionale - Amniocentesi Molecolare (Array-CGH) - QF-PCR - Screening Malattie Genetiche


Le malattie determinate da anomalie di numero (aneuploidie) e struttura dei cromosomi sono tra le più importanti cause di malformazioni congenite, abortività e morte fetale.  Vi è una stretta correlazione tra Età materna e Rischio di anomalia cromosomica: circa 1 caso su 400 a 28-30 anni, 1 caso su 200 a 35 anni, 1 caso su 100 a 38 anni. La Sindrome di Down, dovuta alla presenza di un cromosoma 21 in più (trisomia 21), è la più frequente aneuploidia dei cromosomi non sessuali e la sua incidenza aumenta con l'aumentare dell'età materna: circa 1 caso su 1000 a 28-30 anni, i caso su 400 a 35 anni, 1 caso su 200 a 38 anni. Meno frequenti sono la Sindrome di Edwards (incidenza di circa 1 caso su 6000-8000) dovuta alla presenza di un cromosoma 18 in più (trisomia 18) e la Sindrome di Patau (incidenza di circa 1 caso su 10.000) dovuta alla presenza di un cromosoma 13 in più (trisomia 13). 
Le più frequenti aneuploidie dei cromosomi sessuali sono la Sindrome di Turner dovuta alla mancanza di un cromosoma X nelle femmine (circa 1 caso su 5000) e la Sindrome di Klinefelter dovuta alla presenza di un cromosoma X in più nei maschi (circa 1 caso su 1000).

Le aneuploidie sono causate nella maggior parte dei casi da fenomeni di non-disgiunzione in fase di meiosi con conseguente formazione di due cellule (gameti) di cui una contiene un cromosoma in più ed una un cromosoma in meno; questi fenomeni di non disgiunzione si hanno con maggiore frequenza nella meiosi femminile ed aumentano con l'età. Le anomalie strutturali originano dalla rottura di uno o più cromosomi in qualsiasi punto del genoma e quindi il numero di potenziali riarrangiamenti è praticamente infinito. I riarrangiamenti strutturali vengono distinti in bilanciati e sbilanciati. Nelle alterazioni strutturali bilanciate non vi è perdita o guadagno di materiale genetico per cui le persone portatrici sono in genere fenotipicamente normali. Nelle alterazioni sbilanciate si ha invece perdita-guadagno di materiale genetico per cui il fenotipo è patologico. I principali tipi di anomalie strutturali sono:
  • delezioni e microdelezioni: perdita di un segmento
  • duplicazioni: due copie di un segmento 
  • inversioni: due rotture sul cromosoma e rotazione di 180° del segmento compreso tra i punti di rottura
  • traslocazioni reciproche: rottura di due cromosomi con scambio reciproco dei segmenti
  • traslocazioni Robertsoniane: fusione di due cromosomi rotti in prossimità del centromero
  • cromosomi ad anello o ring: rottura di entrambe le braccia di un cromosoma, perdita delle regioni distali e successiva fusione delle estremità 
  • cromosomi marcatori: presenza di piccole porzioni cromosomiche soprannumerarie

Le tecniche di studio dei cromosomi sono oggi essenzialmente tre: Amniocentesi Tradizionale, Amniocentesi Molecolare (Array-CGH) o Cariotipo Molecolare, QF-PCR (Quantitative Fluorescence PCR).

Amniocentesi Tradizionale

Il cariotipo da liquido amniotico viene effettuato mediante il prelievo di circa 20 ml. di liquido amniotico, sotto controllo ecografico, tra la 15a e la 18a settimana di gestazione. Le cellule estratte dal liquido amniotico dette amniociti, dopo essere state separate dal liquido mediante centrifugazione, vengono poste in coltura (si allestiscono 3 colture) dove si nutrono e crescono in circa 2 settimane. A crescita avvenuta le cellule vengono deposte su di un vetrino dove continuano a moltiplicarsi; dopo 3 giorni la divisione cellulare viene bloccata allo stadio di metafase, la cellula viene aperta e si provoca la rottura della membrana nucleare; a questo punto i cromosomi fuoriusciti dal nucleo si spargono sul vetrino, vengono osservati al microscopio e fotografati. Dalla foto di tutti i cromosomi di una cellula vengono ritagliate le immagini di ciascun cromosoma e disposte ordinatamente come una sorta di collage. I cromosomi vengono allineati in ordine decrescente per dimensioni e disposti in coppie di cromosomi omologhi (uno paterno ed uno materno). Al termine del collage avremo 22 coppie di cromosomi numerate da 1 a 22 per un totale di 44 cromosomi; i 2 cromosomi rimanenti sono i due cromosomi sessuali, il cromosoma X più grande e quello Y più piccolo. Se vi sono 2 cromosomi X avremo un cariotipo femminile, se vi sono 1 cromosoma X e un cromosoma Y avremo un cariotipo maschile.
Alla fine quindi il cariotipo umano è costituito da 46 cromosomi e si indica in questo modo:
  • cariotipo femminile normale 46,XX
  • cariotipo maschile normale  46,XY

Raramente può aversi un insuccesso della coltura ( ad es. per presenza di numerose cellule epiteliali di origine materna che impediscono la crescita delle cellule fetali) ma ciò non significa necessariamente che ci sia una condizione patologica del feto. In tal caso si può effettuare un nuovo prelievo di liquido amniotico oppure optare per il cariotipo molecolare mediante tecnica Array-CGH senza la necessità di ripetere il prelievo.

Quali sono le indicazioni per la determinazione del cariotipo fetale da liquido amniotico:
  • età materna > 35 anni
  • alterazioni cromosomiche nei genitori
  • storia familiare di aneuploidie
  • pregressa aneuploidia fetale
  • mosaicismo alla villocentesi
  • malformazioni fetali rilevate all'esame ecografico
  • aumento di spessore della translucenza nucale nel feto rilevato all'ecografia
  • risultato positivo al test di screening biochimico (duo-test, tri-test)

Tecnica QF-PCR

La Tecnica di amplificazione enzimatica in vitro del DNA fluorescente o QF-PCR (Quantitative Fluorescence PCR) è una tecnica molecolare che permette la diagnosi rapida delle aneuploidie fetali relative ai soli cromosomi 21, 13, 18, X e Y. Oggi tale tecnica ha sostituito completamente la tecnica di ibridazione fluorescente in situ  o FISH (Fluorescence In Situ Hybridazation) per la maggiore rapidità (risultato disponibile in 2-3 giorni) e per la necessità di una minore quantità di liquido amniotico in quanto l'esame è effettuato sul DNA estratto da materiale cellulare non coltivato.
Normalmente tale tecnica è dai vari Laboratori inclusa nell'esecuzione del cariotipo tradizionale.


Amniocentesi Molecolare Array-CGH o Cariotipo Molecolare

Tale tecnica, a differenza dell'Amniocentesi tradizionale, non necessita di coltura cellulare poiche utilizza il cosiddetto Cariotipo Molecolare cioè una procedura diagnostica che impiega una tecnica molecolare e come tale non soggetta al rischio di mancata crescita; inoltre permette di ottenere una analisi cromosomica approfondita in tempi brevissimi. L'Array-CGH (Array - Comparative Genomic Hybridization ) presenta una risoluzione molto più elevata consentendo di identificare patologie derivanti da alterazioni cromosomiche molto piccole (microdelezioni e microduplicazioni, sindromi che implicano il riarrangiamento dei subtelomeri riconosciute tra le cause di ritardo mentale) non evidenziabili col cariotipo tradizionale. Inoltre permette di investigare oltre 150 geni e 100 patologie genetiche di cui le più note sono la Sindrome di Angelman, la Sindrome di De George, la Sindrome di Prader-Willi, la Sindrome di Williams. 


L'Array-CGH è quindi utilizzata per la diagnosi di fenotipi complessi associati a grado variabile di ritardo mentale ma anche come tecnica di routine in diagnosi prenatale in caso di:
  • feto con segni ecografici di sospetto per anomalia cromosomica (es. difetti dello sviluppo fetale) ma con cariotipo tradizionale normale
  • approfondimento per anomalie cromosomiche individuate col cariotipo tradizionale quali riarrangiamenti sbilanciati, riarrangiamenti apparentemente bilanciati de novo e cromosomi marcatori
  • aborti spontanei e terapeutici

I limiti di tale tecnica in ambito prenatale sono rappresentati dalla impossibilità di identificare riarrangiamenti cromosomici bilanciati (non patologici) e i mosaicismi con una linea cellulare scarsamente rappresentata, inferiore al 10%.

E' possibile vedere le 100 patologie investigate e i 150 geni alterati cliccando qui.

Screening Malattie Genetiche

Oltre l'esame del cariotipo tradizionale o molecolare è possibile ricorrere ad uno screening genetico diretto alla diagnosi di alcune malattie quali:
  • Fibrosi Cistica
  • Sindrome del cromosoma X fragile (ritardo mentale)
  • Sordità congenita
  • Distrofia Muscolare di Duchenne-Becker
  • altre anomalie genetiche
Queste patologie possono essere trasmesse da genitori portatori sani, spesso inconsapevoli di esserlo.
In caso di familiarità o sospetto ecografico è possibile eseguire i test per lo screening o la diagnosi di numerose malattie genetiche utilizzando il DNA ottenuto dal liquido amniotico prelevato mediante amniocentesi.

E' possibile sempre con tecniche molecolari (PCR - Polimerase Chain Reaction) la ricerca nel liquido amniotico della presenza del genoma di agenti infettivi, es. Citomegalovirus, Herpes Simplex, Varicella Zooster, Rubeovirus, HIV, Toxoplasma gondii, Parvovirus.


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